二号再生胶囊治疗特发性血小板减少性紫癜的实验研究

 

Key words  TCM; Complex prescription; Idiopathic thrombocytopenic purpura; Treatment; Experimental study    

    特发性血小板减少性紫癜（ITP）是以出血及外周血小板减少，骨髓巨核细胞数正常或增多伴有成熟障碍为主要表现的常见出血性疾病，为自身免疫病，属中医血证、发斑等范畴。目前对本病尚无有效的治疗措施^[1,2]。二号再生胶囊为丹皮、生地、三七、太子参等组成的复方中药制剂，有扶正固本、活血止血、凉血解毒之功效。临床治疗慢性ITP取得了满意的疗效，为了进一步探讨该复方中药抗血小板减少的作用机制，本实验以免疫法建立ITP动物模型，观察中药二号再生胶囊治疗特发性血小板减少性紫癜的疗效并探讨其作用机理，为临床治疗ITP提供实验依据。

1.1  材料

1.1.1实验动物 BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供，二级动物，合格证号：SCXK京 2000-0006。雌雄各半，体重22±2克，共120只，其中60只为建立ITP模型使用。豚鼠 10只，体重400克±20克，由河北医科大学实验动物学部提供。

1.1.2 实验药物  二号再生胶囊由平安医院提供，规格：0.35g×100粒。批号：20040318。阳性对照药：血康口服液，由江西天狮中药集团有限责任公司贵溪制药厂制造，批号：20030115。生理盐水由石家庄第四制药厂制造，批号：20030815。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma产品。

1.1.3实验仪器 显微镜摄像系统，OLYMPUS,日本生产；血细胞分析仪,AITAIKE CA-500,日本制造；离心机，LD4-2型，北京医用离心机厂生产；流式细胞仪(FCM),FACS-420,美国出品。

1.2 方法

1.2.1  免疫性血小板减少性紫癜动物模型的建立  基本的造模方法参照文献^[3，4]加以改进。抗原的制备：取BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，以EDTA-Na₂抗凝从心脏取全血，用生理盐水稀释，分离血小板并洗涤。

1.2.2  免疫方法   取以上血小板分别与等量完全福市氏佐剂和不完全福氏佐剂混合制成油包水状抗原，取含完全福氏佐剂抗原0周注射于豚鼠背部皮下至少六点；取含完全福氏佐剂抗原0周分别于2，4，6，8周，注射于豚鼠足掌和背部皮下至少六点，两月后从豚鼠腹主动脉取血，分离血清，制备成豚鼠抗血小板抗血清(APS)，置56°C水浴灭活30分钟，贮存于-20°C冰箱待用。使用前用等量BALB/c小鼠红细胞吸附两次，用生理盐水稀释成不同浓度APS待用。

1.2.3抗血清效价的检测   参照文献介绍ELISA方法^[1]加以改进，以国产冻干酶联A蛋白纯品代替碱性磷酸酶-蛋白A酶标抗体进行检测。

1.2.4  慢性持续ITP动物模型的建立   取小鼠于0,1,3,5,7,9,天分别给予腹腔注射APS,每次100ul(1:6稀释)，造成小鼠慢性持续性ITP模型。

1.2.5  动物分组   实验设正常对照组、豚鼠血清对照组、模型组、阳性药组、低剂量实验组和高剂量实验组共6组，每组10只。

1.2.6  给药方法：实验组和阳性药对照组均从第一次腹腔注射APS 24小时后灌胃给予不同剂量的药物，阳性药物组给予血康胶囊，20ml·kg^-1d^-1,低剂量组给予二号再生胶囊, 1g·kg^-1d^-1, 高剂量组给予二号再生胶囊, 2g·kg^-1d^-1,其它各组给予等量生理盐水。连续给药10天。

1.2.7  观察指标  观察实验中小鼠的精神活动状况、出血情况、皮毛光泽、饮食饮水量、大小便、体重变化及死亡情况。实验结束后（实验第12天），首先检测各组小鼠出血和凝血时间，然后处死小鼠，眼球取血用血细胞分析仪检测血象，用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群、取脾脏和胸腺称重按照文献介绍方法计算胸腺和脾脏指数^[5]、取脾脏以10%甲醛固定做病理检查，取股骨（右）骨髓涂片，瑞士和Giemsa染色，计数全片的巨核细胞数以及巨核细胞分类计数。

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